Osservazioni sulla fecondazione e lo sviluppo embrionale

di Stefano Toncelli

 

Seconda parte

 

Durante le prime ora dello sviluppo embrionale la membrana che avvolge il vitello si separa dal guscio esterno andando a creare una separazione definitiva alla continuità tra l’embrione e l’ambiente esterno che precedentemente era assicurata dal micropilo ormai chiuso dalla lectina rilasciata dai granuli corticali. Il disegno è però chiaramente ingigantito al fine della comoda spiegazione della sequenza temporale degli eventi.

In effetti il blastodisco in via di sviluppo è quasi impercettibile ad occhio nudo o con l’ingrandimento di una fotografia e può essere facilmente confuso con l’area biancastra delle uova appena deposte che altro non è che la zona adiacente il micropilo, dove il gradiente di concentrazione del tuorlo è molto inferiore rispetto a quello che si riscontra nel polo vegetativo. Per prendere chiara visione dei processi embrionali servono preparati istologici opportunamente colorati.

Il mancato sviluppo delle uova che presentano la lunetta opaca visibile ad occhio nudo, non è quindi certezza che l’uovo sia stato fecondato!

Una bella delusione davvero.

      motilità non raggiungono il micropilo perché muoiono dopo pochi secondi?

Ma come capire quale è la corretta motivazione?

Osservare ipotizzare provare

 

 

Uno dei modi per capire cosa non va è senz’altro quello di lasciare alla natura il tempo per farcelo intendere. La mia coppia di pigeon depone ogni 7 giorni circa e variando la composizione ionica dell’acqua di deposizione alla fine ho notato che a certi valori di durezza totale cominciavo ad avere qualche risultato.

Eppure avevo letto che molte coppie riescono a schiudere a 1.400 microsiemens e che i pigeon di Stendker sono abituati all’acqua dura, eppure leggendo sui forum c’è chi dice di schiudere a questi valori di conducibilità estremi. Ho fatto numerose prove aggiungendo sale da cucina non iodato e tenendo fissa la durezza totale GH ma non ho avuto nessun risultato fino a quando ho lasciato perdere il sentito dire e mi sono detto: ma tutti questi anni di selezione che hanno portato allo sviluppo della livrea dei pigeon possono aver influenzato un processo così sensibile come l’embriogenesi?

Può l’embrione aver sviluppato in così poco tempo la resistenza a quello che potrebbe secondo la mia visione delle cose essere il suo maggior fattore limitante e cioè il bilancio ionico dell’acqua utilizzata per la schiusa che usualmente viene (anche se a volte erroneamente) attribuito alla durezza totale (misura di ioni calcio e magnesio nell’acqua)?

 In effetti alcuni risultati incoraggianti di schiusa li ottenni solo a valori di durezza totale di circa 3°- 4° GH. Bene, forse sono sulla strada giusta.
Ancora non mi spiego il perché della mancata fecondazione fino a che….

Un passo indietro

 

Uno dei meccanismi di protezione dell’uovo deriva appunto dalla funzionalità del micropilo. Le mie uova avevano una percentuale di sbiancamento molto bassa la quale avveniva solamente passate le 48 – 50 ore dalla deposizione e a GH tra 3 e 4 fino a 72 ore dopo la deposizione. Questo mi faceva pensare che non vi fossero problemi legati alla non fecondità della femmina o a condizioni particolarmente avverse dell’acqua di riproduzione.

La polarità dell’uovo era evidente quindi la mia ipotesi era che i primi momenti della fecondazione avvenissero senza grossi problemi ma non intravedevo le successive fasi delle sviluppo caratterizzate dell’imbrunire dell’uovo e dalla successiva schiusa.

Una delle possibili spiegazioni a queste osservazioni vennero dalla lettura di una citazione fatta da una ricercatrice  della sezione di neurochimica e neurobiologia dello Sviluppo dell’università di Genova.

In questa citazione la dottoressa Diana Olivieri parlando dei suoi studi metteva in evidenza che il meccanismo del blocco della polispermia operato dal micropilo e dal rilascio della lectina ad opera dei granuli corticali può avvenire anche in assenza di sperma!
L’uovo si attiva e si prepara per la fecondazione tramite la serie di eventi già evidenziati ma che possono essere scatenati anche artificialmente da una serie di fattori quali:

1.    Attivazione tramite stress meccanico.
L’uovo in questo caso viene punto da un sottile ago in vetro di 15-20 micron di diametro, in modo da simulare l’ingresso dello spermatozoo. Gli alveoli corticali si rompono nel punto in cui è penetrato l’ago e il processo continua da questa regione fino al polo opposto.

2.    Attivazione tramite sostanze chimiche
Sono state utilizzate differenti sostanze chimiche che agiscono sulla superficie dell’uovo.
– Detergenti
– Alcuni acidi inorganici alla concentrazione di 10-3 N
– E alcuni acidi grassi
Tutte queste sostanze si sono rivelate attivatori efficienti, probabilmente emulsionando la superficie citoplasmatica. Si sono invece rilevati inibitori dell’attivazione gli acidi butirrico e valerico.

3.    Attivazione termica
Esperimenti compiuti su uova di pesce hanno dimostrato che possono essere attivate attraverso una breve esposizione a temperature elevate (45°C per 30 sec-4min).

4.    Attivazione elettrica
L’attivazione elettrica causa attivazioni in due modi differenti a seconda dell’intensità del campo elettrico. Se il campo è maggiore di 2 volt per centimetro, la rottura degli alveoli con la successiva separazione del corion, avviene sia all’anodo che al catodo. Quando l’asse che connette il polo vegetale e animale dell’uovo si trova posizionato a 90° rispetto alle linee del campo, l’innalzamento della membrana avviene prima all’anodo che al catodo. Se invece l’asse è parallelo alle linee di campo, l’effetto è più rapido quando il polo animale è diretto verso l’anodo.

5.    Attivazione fotodinamica
In questo caso le uova vengono immerse in sostanze fluorescenti quali la rodamina B o l’eosina ed esposte a raggi ultravioletti. In questo caso l’attivazione coinvolge un elevato numero di uova ma non tutte.

6.    Attivazione supersonica
Vengono utilizzate onde supersoniche per interferire con la superficie delle uova. Anche in questo caso l’efficienza non è del 100%
L’attivazione in vitro scatena l’inizio di una catena di eventi, talora si arriva persino alle prime divisioni della segmentazione (pseudosegmentazione) ma ovviamente lo sviluppo si arresta precocemente.

Spesso manca una spiegazione precisa per gli effetti dell’attivazione dell’uovo causata da alcuni stress. Comunque l’effetto è sempre collegato alla serie di cambiamenti che avvengono normalmente dopo la fecondazione. Primo fra tutti è l’innalzamento della concentrazione di calcio all’interno della cellula uovo. Infatti i primi esperimenti di attivazione in vitro su riccio di mare avevano utilizzato proprio uno ionoforo per il calcio, A23187, che causava ingresso di questo ione dall’acqua di mare verso il citoplasma e il successivo innalzamento della membrana di fecondazione. Nel riccio di mare, nella rana e nei pesci è stata visualizzata un’unica intensa onda di rilascio del calcio dopo la fecondazione, mentre in ascidie, mammiferi, nemertini e vermi si assiste a oscillazioni periodiche prolungate nel tempo.

Uno dei principali attori nel processo di attivazione dell’uovo è mediato quindi dal rilascio dello ione calcio all’interno del citoplasma. E’ stata osservata una vera e propria onda di diffusione del calcio che media il rilascio dei granuli corticali e le primissime fasi dello sviluppo embrionale.
L’onda di calcio è molto precoce, parte immediatamente dopo la penetrazione da parte dello spermatozoo e pochi secondi dopo (9 secondi) il micropilo risulta essere già sigillato.

Il processo di attivazione dell’uovo può avvenire anche in assenza di penetrazione dello spermatozoo!

Numerosi studio effettuati principalmente nei salmoni, attestano che l’uovo si attiva a prescindere dalla presenza o meno dello spermatozoo nel cono di fertilizzazione e addirittura da origine alle prime fasi dello sviluppo embrionale tramite divisioni cellulari aploidi, le quali ovviamente portano alla morte dell’embrione.

Molti esperimenti sono stati fatti sulle specie ittiche che hanno un valore di natura alimentare e gli esiti di questi studi dimostrano una estrema dipendenza dei gameti dalle condizioni ambientali dei media nei quali sono immersi. In particolare è stato riscontrato che i principali  fattori limitanti nel buon esito della fertilizzazione delle uova di salmone sono la temperatura e le concentrazioni ioniche di potassio calcio e magnesio.

Gli spermatozoi di salmone hanno una  forte dipendenza da questi ioni, in assenza di cacio la motilità risulta addirittura completamente assente! Così come l’attivazione delle uova della stessa specie è influenzata dal calcio e dal potassio presente nella soluzione di test.
Nei medesimi studi sono riportate le tempistiche di tali eventi:

1.   Gli spermatozoi di salmone hanno una motilità massima di 4 minuti
2.   L’uovo è fecondabile solo per 2 minuti dal momento dell’attivazione

      di fiume o soluzione test con simile composizione ionica
 

Cosa posso concludere da tutto ciò?

1.    Sicuramente le mie bestiole non hanno nulla che non va nel processo di gametogenesi la dimostrazione di ciò è stata abbastanza semplice, è bastato attendere:

2.    Le condizioni dell’acqua ideali alla schiusa per la mia coppia di discus tedeschi allevata in acqua dura di rubinetto è identica a quella necessaria a tutte le altre coppie che ho avuto la fortuna di allevare e riprodurre: GH 2-3 (schiusa >80%) Ph 5,5-6,5 microsiemens 100-150 max

 

3.    Nel mio caso, il sale da cucina non iodato non ha avuto alcuna influenza sul processo che porta alla fertilizzazione delle uova ne sullo sviluppo embrionale, dando solo qualche blando beneficio per quello che riguarda il leggero potere batteriostatico che nelle mie condizioni di allevamento è ininfluente. Ha però determinato una leggera inibizione della reazione corticale o le prime fasi dell’attivazione dell’uovo ai seguenti valori: GH 6, microsiemens 700 ottenuti aggiungendo appunto sale da cucina non iodato (osservazione di uova limpide senza reazione corticale)

4.    La piccola semiluna che si nota al polo animale già durante le prime ore post fecondazione è con buona probabilità dovuta alla reazione corticale e dalle fotografie da me fatte non è possibile riconoscere con chiarezza il blastodisco e le prime fasi della differenziazione cellulare che originano i foglietti embrionali ma solo l’insieme dei tre fattori che attestano solamente la funzionalità dell’uovo.

 

5.    Senza preparazioni istologiche si riesce a distinguere con discreta approssimazione un uovo fecondato da uno non fecondato solo dopo le 24 ore e l’embrione diventa sempre più evidente man mano che passano le ore.

6.    Mi sentirei di ipotizzare che se un grande numero di uova sbiancano entro le prime 12 ore dalla deposizione il problema principale sia dovuto alla mancata fertilizzazione e chiusura del micropilo dovuta ad una concentrazione ionica sbilanciata (povera) dell’ambiente di sviluppo o a sterilità della femmina.

 

7.    Uova che presentano una netta separazione del tuorlo al polo animale durante le prime 24 ore dalla presunta fertilizzazione sono uova che non riusciranno a svilupparsi in quanto dalle osservazioni effettuate le uova che hanno dato origine ad una larva sono state sempre e solamente quelle dove tale separazione non è visibile ad occhio nudo ma solo tramite fotografia a elevata risoluzione.

8.    Le uova fertili della mia coppia di discus tedeschi presentano chiaramente una accentuata reazione corticale, che porta allo sviluppo dello spazio perivitellino di dimensioni non superiori a circa 1/15 della lunghezza verticale dell’uovo. E’ quindi chiaro che data la fertilità accertata dell’uovo che poi si schiuderà, la zona traslucida apicale sia l’insieme dato dai primi processi di differenziazione embrionale.

 

 

 

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